Introduction
Les kinases interviennent dans la plupart des voies métaboliques cellulaires.
Elles catalysent une réaction de phosphorylation de leur substrat en présence d’ATP.
Principe
La détection de l’activité d’une kinase peut être réalisée par la détection de la phosphorylation du substrat, par le dosage de l’ATP résiduel de la réaction ou par la quantité d'ADP produit.
1. Détection de la phosphorylation du substrat : test HTRF® KinEASE (CISBIO)
Deux fluorophores partenaires donneur (cryptate d’europium) / accepteur (XL665) sont fusionnés respectivement à un anticorps spécifique de la phosphorylation et à la streptavidine qui se lie au substrat biotynilé.
Le transfert d’énergie en temps retardé (TR-FRET) entre le couple de fluorophores est proportionnel à l’activité enzymatique.
2. Dosage de l’ATP résiduel : test Kinase-GloTM (PROMEGA)
La réaction enzymatique est arrêtée par ajout d’une luciférine et de sa luciférase qui, en présence de Mg 2+ et d’ATP, catalyse son substrat en oxyluciférine avec émission d’un photon.
La réaction est quantifiée par mesure du signal luminescent qui est proportionnel à la quantité d’ATP présent dans le milieu réactionnel et donc inversement proportionnel à l’activité enzymatique.
3. Dosage de l’ADP produit par la réaction : test ADP-GloTM (PROMEGA)
La réaction enzymatique est stoppée par l’ajout d’un réactif qui déplète l’ATP résiduel.
Un second réactif est alors ajouté pour convertir l’ADP produit en ATP qui lui-même est dosé par une réaction luciférine/luciférase.
Le signal luminescent mesuré est proportionnel à la quantité d’ADP produit par la réaction enzymatique.
4. Dosage de l’ADP produit par la réaction : test ADP-QuestTM (DISCOVERX)
L’ADP formé est quantifié par une réaction enzymatique faisant intervenir une pyruvate kinase et une pyruvate oxidase.
L’ADP est transformé en peroxide d’hydrogène, lui-même détecté grâce à une peroxidase en présence de son substrat (Amplex Red) par la production de Résorufine fluorescente.
Le signal de fluorescence mesuré est proportionnel à la quantité d’ADP produit par la réaction enzymatique.
Protocole
| REACTION ENZYMATIQUE | |||
|---|---|---|---|
| Format | 384 puits | ||
| Substrat + ATP +Kinase +/- inhibiteur Conditions de la réaction à définir | |||
| REVELATION ENZYMATIQUE | |||
| Test HTRF® KinEASE (CISBIO) | Tests Kinase-Glo / ADP-Glo (PROMEGA) | Test ADP-Quest (DISCOVERX) | |
| Détection | Longueur d’onde d’excitation : 337 nm Longueur d’onde d’émission 1 : 615 nm (émission du fluorophore donneur) Longueur d’onde d’émission 2 : 665 nm (émission du fluorophore accepteur) | Mesure US Luminescence | Mesure fluorescence Longueur d’onde d’excitation : 530 nm |
Notes :
- Prévoir 50 µL à 10 mM ou 3 mg d'échantillon pour tester 5 concentrations (3 points/concentration)
Inhibition de l'activité enzymatique de MSK-1
Détermination des paramètres cinétiques d'une hiskinase
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