Dosage de la sécrétion de monoxyde d'azote par des macrophages murins

Introduction

Le monoxyde d’azote (NO) exerce un rôle clef dans la réponse inflammatoire en activant plusieurs voies de signalisation permettant d’exacerber les effets délétères du stress oxydant.

Le dosage du monoxyde d’azote (NO) constitue donc une cible biologique pertinente dans la recherche d’actifs anti-inflammatoires.

Principe

L’ accumulation de nitrite est considérée comme un indicateur de la production de NO dans le milieu de culture.

Le NO est physiologiquement instable et est rapidement oxydé en nitrite et nitrate. Ce dernier est ensuite réduit en nitrite par l’action de la nitrate réductase.

Il devient ainsi possible de quantifier indirectement la production de NO via le dosage de nitrite grâce à la réaction de Griess.
[Archer S.1993]

Protocole

Format96 puits  
Modèle cellulaireRAW 264.7 (ATCC TIB-71)
StimulationLPS
Molécules de référenceQuercetol ; L-NMMA
Incubation24H à 37°C sous 5% CO
RévélationRéaction de Griess avec mesure d'absorbance à 544 nm

Notes :

  • Prévoir 50 µL à 10 mM ou 3 mg d'échantillon pour tester 5 concentrations (3 points/concentration)
  • L'inhibition de la sécrétion de nitrite est corrélée à la viabilité cellulaire.

Recommandation :

  • S'assurer de la solubilité de l'échantillon dans un solvant compatible avec la culture cellulaire

Inhibition de la sécrétion de nitrite en présence de L-NMMA et Quercetol