Mesure de la liaison récepteur-ligand par FRET

Introduction

La technologie de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) est liée à la distance séparant 2 fluorophores, elle permet de mesurer des distances de quelques dizaines d’angström, et est donc une technique de choix pour étudier les interactions moléculaires.
Ici, elle permet de mesurer la liaison entre un récepteur membranaire fusionné à un fluorophore et un ligand fusionnée à un autre fluorophore. 
La liaison est mesurée sur cellules entières vivantes. Le test est réalisé en conditions homogènes et ne nécessite donc aucun lavage.

Principe

Les cellules surexpriment le récepteur fusionné à un fluorophore donneur, la GFP (Green Fluorescence Protein).

Une sélection de constructions plasmidiques et de cellules  sont accessibles  à PCBIS

Le ligand est fusionné à un fluorophore accepteur compatible,  dont le spectre d’excitation recouvre au moins partiellement le spectre d’émission du fluorophore donneur.
Le FRET est un transfert d’énergie non radiatif entre le fluorophore donneur à l’état excité et le fluorophore accepteur, lorsqu’ils sont suffisamment proches. Il en résulte une diminution de la lumière émise par le fluorophore donneur, et une augmentation de la lumière émise par le fluorophore accepteur.
La détection de l’interaction entre le récepteur et le ligand rendus fluorescents, qui se traduit par une diminution de la fluorescence du fluorophore donneur, est réalisée par un lecteur de microplaques  ou un spectrofluorimètre. Par compétition, il est possible de détecter la liaison d’une molécule non marquée sur le récepteur.

Protocole

A adapter en fonction de l’essai

Format96 puits  ou cuves de 1 mL
Modèle cellulaireHEK293 en suspension 
possibilité de travailler sur d’autres lignées
Distribution des cellules
Lecture de la ligne de base
Ajout du ligand fluorescent et du composé non marqué à tester
Incubation
Lecture

Notes :

  • Quantité de cellules exprimant le récepteur d’intérêt (lignée transitoire ou stable) à définir lors de la validation du test
  • Prévoir 50 µL de ligand marqué en solution à 10 mM dans DMSO

Liaison d'une sonde fluorescente fusionnée à la lissamine sur le récepteur de l'apéline

Format : cuve  de 1 mL

Cellules  : HEK293 en suspension surexprimant le récepteur de l’apéline fusionné à la GFP

Tous les modèles peuvent être adaptés à votre demande.