Introduction

L’ adénosine 3’, 5’-monophosphate cyclique (AMPc) est un des plus importants seconds messagers, intervenant dans les réponses physiologiques de neurotransmetteurs, hormones et médicaments.
L’ AMPc est produit à partir d’adénosine triphosphate (ATP) par l’adénylate cyclase membranaire. La régulation de la concentration intracellulaire en AMPc est contrôlée par l’équilibre entre sa synthèse à partir d’ATP et sa dégradation rapide en 5'-AMP par une phosphodiestérase (PDE). Certains récepteurs RCPG peuvent contrôler la production d’AMPc en agissant via l’activation de protéines G spécifiques, capables de stimuler (Gs) ou d’inhiber (Gi) sa production.

La mesure de l’AMPc intracellulaire est donc une méthode permettant de mesurer l’effet de composés sur certains RCPG.

Principe

L'essai est basé sur la compétition entre l’AMPc traceur marqué avec l'europium et l’AMPc de l’échantillon pour la liaison sur à des anticorps anti-cAMP marqués avec le colorant ULight™.
En l’absence d’AMPc libre, les anticorps se lient à l’AMPc traceur, l’énergie émise par l’europium excité à 320 ou 340nm est transférée par FRET aux molécules ULight™ qui émettent à 665nm, le signal TR-FRET est maximal. En présence d’AMPc libre, il y a compétition pour la liaison aux anticorps, le signal TR-FRET est donc diminué.

Protocole

Format384 puits
Modèle cellulaireHEK293 en suspension   possibilité de travailler sur d’autres lignées
Récepteur

RCPG couplé Gαs

Distribution des cellules dans la plaque
Stimulation avec les composés d'intérêt
Ajout des solutions d’AMPc traceur et d’anticorps anti-AMPc-ULight
DétectionLongueur d’onde d’excitation : 320 nm
Longueur d’onde d’emission 1 : 665 nm
émission du fluorophore donneur
Longueur d’onde d’emission 2 : 615 nm
émission du fluorophore accepteur

 

Notes :

  • Quantité de cellules exprimant le récepteur d’intérêt (lignée transitoire ou stable) à définir lors de la validation du test
  • Prévoir 2 à 3 mg de composés à tester

Recommandation :

  • S'assurer de la solubilité de l'échantillon dans un solvant compatible avec la culture cellulaire

Stimulation du récepteur à la vasopressine et mesure du signal AMPc associé

Format : 384 puits
Cellules  : HEK293 surexprimant le récepteur à la vasopressine AVPR2

 

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