Mesure de flux calcique intracellulaire

Introduction

Le calcium est impliqué dans de nombreux processus physiologiques (libération de neurotransmetteurs, contraction musculaire, coagulation sanguine…) et dans la signalisation cellulaire où il agit comme un second messager suite à l’activation des protéines hétérotrimériques  Gq via les récepteurs couplés aux protéines G.
Ce test permet de suivre de manière dynamique les variations de concentration intracytoplasmique de calcium sur des cellules vivantes.

Principe

Les mesures de flux calciques sont réalisées via l’utilisation d’une sonde fluorescente sensible au calcium (Indo1 ou Fluo4). Selon la nature de la sonde, sa liaison avec le calcium induit une variation de son intensité de fluorescence et éventuellement un déplacement de son spectre d’émission :

Les sondes sont rendues perméantes par l’ajout d’un groupement acétométhylester (AM), et peuvent ainsi sous cette forme passer la membrane plasmique des cellules.  La partie AM est libérée à l’intérieur de la cellule par des estérases intracellulaires .
Les mesures sont réalisées sur un lecteur semi-robotisé (Flexstation3® Molecular Devices) qui permet de détecter en temps réel la libération de calcium intracellulaire.

Protocole

Format     96 ou 384 puits
Modèle cellulaire     HEK293 en suspension   possibilité de travailler sur d’autres lignées
Sonde calcique     

      Indo1-AM (λex338nm / λem1401nm, λem2475nm)

      Fluo4-AM (λex494nm / λem516nm)

Chargement des cellules avec la sonde   
Décollement des cellules et distribution dans la plaque
Mesure du signal de base
Traitement des cellules avec les composés d’intérêt + mesure

Possibilité de faire jusqu’à 3 traitements consécutifs.

Notes :

  • Quantité de cellules exprimant le récepteur d’intérêt (lignée transitoire ou stable) à définir lors de la validation du test
  • Prévoir 2 à 3 mg de composés à tester

Recommandation :

  • S'assurer de la solubilité de l'échantillon dans un solvant compatible avec la culture cellulaire

Stimulation du récepteur de l'ocytocine et mesure du signal calcique associé

Format : 384 puits
Cellules : HEK293 surexprimant le récepteur de l'ocytocine

Tous les modèles peuvent être adaptés à votre demande.